關(guān)于WB實(shí)驗(yàn)中的NC膜你知道多少？

時(shí)間：2023/11/24閱讀：1972

首先了解下，體外診斷原料的NC和蛋白轉(zhuǎn)移的NC是有區(qū)別的：體外診斷原料的NC膜是作為核心載體原料，孔徑在10-15μm，帶背襯。而蛋白轉(zhuǎn)移的NC膜，一般用于WB實(shí)驗(yàn)，孔徑0.22um和0.45um，不帶背襯。

其次用在免疫印跡中最常規(guī)的膜的類(lèi)型是硝酸纖維素膜（NC 膜）和聚偏氟乙烯（PVDF）膜。兩者主要區(qū)別：

產(chǎn)品	Biotrace NT 膜	FluoroTrans W PVDF 膜
推薦貨號(hào)	66485	BSP0161
描述	純硝酸纖維素，0.22μm	聚偏氟乙烯，0.2μm
應(yīng)用	蛋白轉(zhuǎn)移核酸檢測(cè) ELISA	蛋白轉(zhuǎn)移蛋白點(diǎn)或條印跡免疫染色檢測(cè)
優(yōu)勢(shì)	高靈敏度低背景	最高的靈敏度低背景低 burn through 高結(jié)合力化學(xué)品抗性高拉伸強(qiáng)度
結(jié)合反應(yīng)	疏水和靜電	疏水（甲醇浸泡）
固定方法	Western 轉(zhuǎn)移點(diǎn)或條印跡烤和紫外交聯(lián)（用于核酸）	Western 轉(zhuǎn)移點(diǎn)或條印跡

轉(zhuǎn)印膜的免疫印跡常見(jiàn)問(wèn)題分析與解決方案

問(wèn)題	可能原因	解決方案
沒(méi)有陽(yáng)性條帶或很弱	抗體活性低或效價(jià)低	分裝和在零下 20 度儲(chǔ)存抗體溶液以及避免多次反復(fù)凍融。使用更高濃度的一抗。
轉(zhuǎn)膜不充分（轉(zhuǎn)膜后通過(guò)凝膠染色得到了確認(rèn)）	增加轉(zhuǎn)膜的時(shí)間。降低轉(zhuǎn)膜緩沖液中甲醇的濃度。加入 0.1%的 SDS 能夠幫助大蛋白的轉(zhuǎn)膜。
低的偶聯(lián)活性	確保膠和膜之間沒(méi)有氣泡。使用不含 SDS 的轉(zhuǎn)膜緩沖液。如果使用的是 Biotrace NT 膜，則需在轉(zhuǎn)膜緩沖液中加入甲醇
封閉劑干擾了抗體的結(jié)合	在 4 度儲(chǔ)存偶聯(lián)物。增加偶聯(lián)物的濃度或孵育時(shí)間。
背景高	使用一個(gè)不同的封閉劑。
抗體和酶偶聯(lián)的效果差	顏色反應(yīng)時(shí)間太長(zhǎng)	當(dāng)需要的顏色深度達(dá)到之后立即停止反應(yīng)
封閉不全	使用親和純化的二抗。
封閉劑中存在磷酸酶或過(guò)氧化物酶的活性	增加封閉時(shí)間。使用一個(gè)不同的封閉劑。
背景點(diǎn)狀物	緩沖液中存在顆粒	試劑使用前用過(guò)濾器過(guò)濾。
假陽(yáng)性或點(diǎn)狀	一抗的交叉反應(yīng)	進(jìn)一步純化或預(yù)吸附膜抗體。如果條件可以的話(huà)使用單抗。降低一抗的濃度。
樣本中存在磷酸酶或過(guò)氧化物酶的活性（通過(guò)在檢測(cè)中不加一抗和二抗得到確認(rèn)）	在封閉前通過(guò) 80 度 20 分鐘加熱來(lái)失活酶的活性。

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